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细胞的原代培养

来自于供体的组织或细胞在体外进行的首次培养即为原代培养。原代培养的细胞主要特点是生物学特性与在体细胞最为接近。因此,原代培养的细胞可被广泛地应用于药物测试、细胞分化等实验研究中。

组织块法和消化法是两种重要的、常用的原代培养方法。组织块法是将刚离体的、有旺盛生长活力的组织剪成小块,接种于培养瓶中,新生的细胞大约24h后可从贴壁的组织块四周游出并生长。利用组织块法进行的原代培养,操作过程简便、易行,培养的细胞较易存活,在对一些来源有限、数量较少的组织进行原代培养时,首先可选择组织块法。

结合化学与生化的手段,将已剪切成较小体积的动物组织中妨碍细胞生长的间质(基质、纤维等)加以消化,使组织中结合紧密的细胞连接松散、相互分离,形成含单细胞或细胞团的悬液。冈单细胞或细胞团易于从外界吸收养分和排出代谢产物,经体外适宜条件培养后,可以得到大量活细胞,在短时间内细胞可生长成片,此种原代培养的方法即为消化法。

消化试剂的种类较多,各种消化剂作用的机制各不相同,不同组织可选用不同的消化剂来进行消化。酶是常用的消化试剂,在原代培养中,对于一些间质少、较软的组织,如上皮、肝、肾、胚胎等,选择胰蛋白酶来加以消化可收到较好的效果。胶原酶因其对胶原有较强的消化作用,因此,适合用在对纤维性组织、一些较硬的癌组织等的消化中。上皮细胞对胶原酶的耐受力较强,用胶原酶消化上皮组织,在去除细胞间质、使上皮细胞与纤维成分分离的同时,上皮细胞也不会受到伤害。

除酶以外.在一些组织,尤其是上皮组织的原代培养中,还常用到一些非酶性的消化剂,如。EDTA。上皮组织的完整性有赖于其生存环境中的Ca2+ 、Mg2+,通过吸收、螯合这些离子,EDTA可使上皮组织细胞彼此间发生分离。

【实验用品】

材料:新生大鼠

器材:眼科弯剪、不锈钢筛网(100目)、三角烧瓶、离心管、弯头吸管、注射器、磁力搅棒及搅拌器、10cm培养皿、培养瓶、计数板、倒置显微镜、离心机

【试剂配制】

D-Hanks平衡液

取市售D-Hanks干粉1袋,剪开包装后将干粉溶于适量双蒸水中;在1000ml容量瓶中调节pH为7.2~7.4.并将D-Hanks液定容至。1000ml;将1000ml  D-Hanks液分装到数个生理盐水瓶中.每个瓶塞上插入2只注射器针头,55.16kPa高压蒸气灭菌20~30min;从高压锅内取出装有D-Hanks液的生理盐水瓶后,立即拔出针头并在针孔处贴上胶布,以防溶液被细菌污染:4℃保存,使用时可加入青霉素和链霉素双抗溶液,使二者终浓度都达到100U/ml。

DMEM培养基

取市售DMEM培养基,小心剪开包装,将干粉溶于适量双蒸水中,并用适量双蒸水冲洗包装袋内侧面,将溶液定容至[000ml;根据包装袋上的说明添加NaHCO3;调节溶液pH7.4左右:加入青霉素和链霉素,使两者的最终浓度都达到100U/ml;采用0.22μm孔径的滤膜正压过滤除菌并分装培养基:①取出已消毒的微孔滤膜不锈钢滤器;②在不锈钢滤器的上层与下层之间.放置孔径为0.22μm的滤膜,滤膜的光面朝上;③向不锈钢滤器中轻轻加入培养基;④向不锈钢滤器加压;⑤将已经过滤的培养基分装于100ml小瓶中;-20℃保存,使用时再加入10%~20%血清,并再次用上述方法过滤除菌。

胰蛋白酶消化液

将D-Hanks平衡液高压消毒,用NaHCO3液调节pH至7.2左右;称取所需量的胰蛋白酶.加入少量D-Hanks平衡液,搅拌均匀后再补足D-Hanks平衡液,搅拌混匀;将配制的胰蛋白酶液加以粗滤后,再用注射滤器进行除菌及消毒:①打开直径为25mm的注射滤器;②将孔径为0.22μm的微孔滤膜光面朝上放置于滤器中;③将滤器安装在注射器上;④向注射器中加入需过滤的胰蛋白酶液;⑤推动注射器,使胰蛋白酶液经过滤膜过滤;将已过滤的胰蛋白酶液分装成小瓶;4℃或-20℃保存备用。

【实验步骤】

(1)组织块法(以新生大鼠肝细胞的原代培养为例):

1)用75%乙醇溶液棉球反复擦拭新生大鼠全身3遍。

2)将大鼠移人超净工作台后,再用75%乙醇溶液擦拭1次。

3)断头法处死大鼠,用眼科剪打开腹腔,取出肝组织,置于培养皿中。

4)用D-Hanks液反复冲洗肝组织3遍,去除血细胞。

5)为避免杂细胞的污染,需用眼科镊将肝组织块上所附的结缔组织尽可能去除。

6)将肝组织移人一新的培养皿中,滴0.5ml培养基于肝组织上,用眼科剪将其剪成1/mm3左右的小块,同时用眼科镊将其彼此分升。

7)用弯头吸管将剪碎的肝组织块吸起,移八培养瓶底部。

8)用弯头吸管头移动肝组织块,使其均匀分布于培养瓶底部,小块间距控制在0.5cm左右,即25ml培养瓶中放置15~20块。

9)吸取少量培养基,沿培养瓶颈缓缓滴人,培养基的量以恰好能浸润组织块底部、但不会使组织块漂浮为佳。

10)将培养瓶轻轻放入培养箱中培养。24h后镜检。当观察到有少量细胞从组织块周围游离而出时,表明需要补充少量培养基。

(2)消化法(以胰蛋白酶消化为例):

1)将新生大鼠的肝组织用D-Hanks液漂洗3次。

2)用眼科剪、镊将附着在肝组织上的结缔组织去除。

3)将肝组织剪成1~2mm3左右的小块,置于三角烧瓶中,放人磁力搅拌棒,再注入30~50倍组织量的预热到37℃的胰蛋白酶液。

4)在磁力搅拌器上对肝组织块进行搅拌10~20min。也可将三角瓶故入水浴或温箱中,每5min摇动1次。如消化时间较长,可每隔5min取出2/3上清液移入另一离心管.离心后去除胰蛋白酶加入含血清培养基,然后再给原三角烧瓶添加新的胰蛋白酶继续消化。若在4℃条件下进行冷消化,消化的时间需延长至12~24h。如果肝组织块在冷消化一段时间后,可离心再添加胰蛋白酶,放入37%温箱中继续温热消化20~30min,效果会较好。

5)吸取少量消化液在倒置显微镜下观察,若组织块已分散成小的细胞团或单个细胞,应立即终止消化。

6)将消化液和分次收集的细胞悬液通过不锈钢网滤过,除掉未消化充分的大块组织。

7)将收集的细胞悬液800~1000r/min离心3~5rain,去除含胰蛋白酶的上清液。

8)用D-Hanks液漂洗1~2次,每次800~1000r/min离心3~5min,去除上清液。

9)加入含10%血清的DMEM培养基,吹打沉淀制悬,按5x105~1x106个/ml细胞的密度接种到培养瓶,于37℃条件下培养。

【结果分析】

(1)组织块法培养的细胞观察:利用倒置显微镜观察发现,经培养24h的组织块边沿有少量细胞游离出来;随着培养时问延长,组织块周围细胞的数量明显增多。这些细胞的核较大.胞质中内含物少、透明度高,彼此间排列紧密。靠近组织块的细胞胞体较小、较圆,离组织块较远的区域可见有多角形的细胞,体积较大,有些细胞的形态介于圆形与多角形之间。

(2)胰蛋白酶消化法培养的细胞观察:在倒置显微镜下.刚接种于培养瓶中时,细胞是悬浮于培养液中的,细胞形态均呈现为圆形。24h后,大多数细胞已贴附于培养瓶底部,胞体伸展后.重新呈现出其肝细胞原有的、不规则多角形上皮性细胞特征。48h以后,细胞进入增殖期.细胞数量明显增多,在接种的细胞或细胞团周围可见有新生的细胞,这些细胞因内含物少而较为透明,胞体轮廓通常较浅。96h以后,新生的细胞可连接成片,同时胞体透明度减弱、轮廓增强,核仁明显可见。

【注意事项】

(1)组织块法中,D-Hanks 液对肝组织的冲洗要充分,尽量去除血细胞,避免其溶血后对肝细胞的生长产生影响。

(2)组织块的体积应控制在1mm3左右,这样其中心部位的细胞才可获得充足的养分。体积过大的组织块其中心部位细胞常会因营养不足而发生死亡、溶解,由此会对周围细胞的生长产生影响。

(3)培养瓶中组织块摆放的密度不能过大,否则细胞将会因为营养不足而活性不佳。此外.为了避免组织块漂浮、不贴壁,第一次加入培养基的量要少,而在移动和观察细胞时,动作也要轻,因为培养基的振荡也会影响组织块的贴壁。

(4)消化法中,因Ca2+ 、Mg2+及血清均具有抑制胰蛋白酶活性的作用,消化过程中使用的所有液体.应均不含有这些离子及血清,消化后可直接加含血清培养基使其灭活。

(5)在选择消化时间时,应考虑到胰蛋白酶的浓度及pH对消化效果的影响,胰蛋白酶常用浓度为0.25%,pH8.9,消化时温度最好控制在37℃。一般新配制的胰蛋白酶液消化力很强.所以开始用时要注意观察,严格限制消化时间,以免消化过度。

胰蛋白酶主要适用于消化细胞间质较少的软组织,如胚胎、上皮、肝、肾等组织,但对于纤维性组织和较硬的癌组织的效果差。

(6)由于原代培养过程较长,因此,应严格进行无菌操作,避免细菌、霉菌等的污染。
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