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细胞原代培养的原理介绍及注意事项!

一、原理

将动物机体的各种组织从机体中取出,经各种酶(常用胰蛋白酶)、螯合剂(常用EDTA)或机械方法处理,分散成单细胞,置合适的培养基中培养,使细胞得以生存、生长和繁殖,这一过程称原代培养。

二、仪器、材料及试剂

仪器:培养箱(调整至37℃),培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱(37℃)

材料:胎鼠或新生鼠

试剂:1640培养基(含20%小牛血清),0.25%胰酶,Hank’s液,碘酒

三、操作步骤

(一)胰酶消化法

1、器材:将孕鼠或新生小鼠拉颈椎致死,置75%酒精泡2—3秒钟(时间不能过长、以免酒精从口和肛门浸入体内)再用碘酒消毒腹部,取胎鼠带入超净台内(或将新生小鼠在超净台内)解剖取肝脏,置平皿中。

2、用Hank’s液洗涤三次,并剔除脂肪,结缔组织,血液等杂物。

3、用手术剪将肝脏剪成小块(1mm2),再用Hank’s液洗三次,转移至小青霉素瓶中。

4、视组织块量加入5—6倍的0.25%胰酶液,37℃中消化20—40分钟,每隔5分钟振荡一次,或用吸管吹打一次,使细胞分离。

5、加入3—5ml培养液以终止胰酶消化作用(或加入胰酶抑制剂)。

6、静置5—10分钟,使未分散的组织块下沉,取悬液加入到离心管中。

7、1000rpm,离心10分钟,弃上清液。

8、加入Hank’s液5ml,冲散细胞,再离心一次,弃上清液。

9、加入培养液l—2 ml(视细胞量),血球计数板计数。

10、将细胞调整到5×105/ml左右,转移至25ml细胞培养瓶中,37℃下培养。

上述消化分离的方法是zui基本的方法,在该方法的基础上,可进一步分离不同细胞。细胞分离的方法各实验室不同,所采用的消化酶也不相同(如胶原酶,透明质酶等)。

(二)组织块直接培养法

自上方法第3步后,将组织块转移到培养瓶,贴附与瓶底面。翻转瓶底朝上,将培养液加至瓶中,培养液勿接触组织块。入37℃静置3—5小时,轻轻翻转培养瓶,使组织浸入培养液中(勿使组织漂起),37℃继续培养。

四、注意事项

1、自取材开始,保持所有组织细胞处于无菌条件。细胞计数可在有菌环境中进行。

2、在超净台中,组织细胞、培养液等不能暴露过久,以免溶液蒸发。

3、凡在超净台外操作的步骤,各器皿需用盖子或橡皮塞,以防止细菌落入。

五、无菌操作的几个注意事项

1、操作前要洗手,进入超净台后手要用75%酒精或0.2%新洁尔灭擦试。试剂等瓶口也要擦试。

2、点燃酒精灯,操作在火焰附近进行,耐热物品要经常在火焰上烧灼,金属器械烧灼时间不能太长,以免退火,并冷却后才能夹取组织,吸取过营养液的用具不能再烧灼,以免烧焦形成碳膜。

3、操作动作要准确敏捷,但又不能太快,以防空气流动,增加污染机会。

4、不能用手触已消毒器皿的工作部分,工作台面上用品要布局合理。

5、瓶子开口后要尽量保持45°斜位。

6、吸溶液的吸管等不能混用。

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